凝膠過濾的應用
更新時間:2021-12-09 點擊次數:2762
凝膠過濾是依據分子量的不同來進行分離的,由于它的這一分離特性,以及它具有簡單、方便、不改變樣品生物學活性等優(yōu)點,使得凝膠過濾成為純化生物大分子的一種重要手段,尤其是對于一些大小不同,但理化性質相似的分子,用其他方法較難分開,而凝膠過濾無疑是一種合適的方法,例如對于不同聚合程度的多聚體的分離等。
凝膠過濾測定分子量操作比較簡單,所需樣品量也較少,是一種初步測定蛋白分子量的有效方法。這種方法的缺點是測量結果的準確性受很多因素影響。由于這種方法假定標準物和樣品與凝膠都沒有吸附作用,所以如果標準物或樣品與凝膠有一定的吸附作用,那么測量的誤差就會比較大。計算公式成立的條件是蛋白基本是球形的,對于一些纖維蛋白等細長形狀的蛋白不成立。另外由于糖的水合作用較強,所以用凝膠過濾測定糖蛋白時,測定的分子量偏大,而測定鐵蛋白時則發(fā)現測定值偏小。
利用凝膠過濾進行脫鹽及去除小分子雜質是一種簡便、有效、快速的方法,它比一般用透析的方法脫鹽要快得多,而且一般不會造成樣品較大的稀釋,生物分子不易變性。一般常用的是月旭科技Tandex G-25,并且目前已有多種脫鹽柱成品出售,使用方便,可多次使用。
熱源物質是指微生物產生的某些多糖蛋白復合物使人體發(fā)熱的物質,它們是一類分子量很大的物質,所以可以利用凝膠過濾的排阻效應將這些大分子熱源物質與其他相對分子量較小的物質分開。例如對于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質,凝膠過濾是一種簡單而有效的方法。
利用凝膠顆粒的吸水性可以對大分子樣品溶液進行濃縮。例如將干燥的Tandex(粗顆粒)加入溶液中,Tandex可以吸收大量的水,溶液中的小分子物質也會滲透進入凝膠孔穴內部,而大分子則被排阻在外。通過離心或過濾去除凝膠顆粒,即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變溶液的離子強度和pH值。
為了減少高濃度下的聚集反應,凝膠過濾層析技術也可以用來進行蛋白的體外復性。層析介質的隔離作用,降低了蛋白之間相互作用產生的聚集,使復性濃度、復性率都得到很大的提高。同時,蛋白經過凝膠過濾層析本身也可得到一定的純化。
兩個重要的因素影響凝膠過濾層析復性蛋白的收率:第一個是變性條件下蛋白質的上樣,第二個是復性緩沖液中蛋白質結構的變化。另外,蛋白質上樣量也會影響蛋白質復性收率,因為在層析柱的頂端會因為上樣量的增加而發(fā)生結構的聚集。
為了提高蛋白質復性效率,發(fā)展了一種梯度凝膠過濾層析復性方法。在色譜柱中預先設置變性劑濃度的梯度,當復性的蛋白質進入到柱子中后,由于蛋白質的表觀分子量遠遠大于變性劑,從而蛋白質經過了一個變性劑濃度逐步降低的環(huán)境,蛋白質逐步地折疊復性,從而有效地降低了聚集體的形成,并能把聚集體和折疊的蛋白質進行分離。
線性梯度在凝膠過濾層析中可能經常會遇到,但是有時有些蛋白質可能在某些變性劑濃度下不穩(wěn)定,在梯度過程中需要盡快跨越這些濃度過程;有時蛋白質折疊的限速在某些變性劑濃度下,此時需要增加此段的時間,所以在凝膠過濾層析中可以設計不同類型的梯度形式,以滿足不同的蛋白質的復性需要。